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熒光染料大總結

    

    熒光顯微鏡技術的基本原理是借助熒光劑讓細胞成分呈現高度具體的可視化效果,比如在目的蛋白后面連一個通用的熒光蛋白—GFP。在組織樣本中,目的基因無法進行克隆,則需要用免疫熒光染色等其他技術手段來觀察目的蛋白。為此,就需要利用抗體,這些抗體連接各種不同的熒光染料,直接或間接地與相應的靶結構相結合。此外,借助熒光染料,熒光顯微鏡技術不只局限于蛋白質,它還可以對核酸、聚糖等其他結構進行染色,即便鈣離子等非生物物質也可以檢測出來。本文就對幾種常用的熒光劑進行了具體的介紹。

免疫熒光 (IF)

    在熒光顯微鏡技術中,可以通過兩種方式觀察到你的目的蛋白:利用內源熒光信號,即通過克隆手段,用遺傳學方法將熒光蛋白與目的蛋白相連;或利用熒光標記的抗體特異性結合目的蛋白。有些生物學問題采用第二種方法會更有用或更有必要。比如,組織學樣品無法使用熒光蛋白,因為通常來說,標本都是從無法保存熒光蛋白的生物體中獲取。此外,當有一個有功能的抗體可用時,免疫熒光法會比熒光蛋白技術快很多,因為后者必須先克隆目的基因再將DNA轉染到適當的細胞中。熒光蛋白的另一項劣勢在于其本身屬于蛋白質。因此,細胞內的這些熒光蛋白具有特定的蛋白質特性,其會導致附著的目的蛋白質發生功能紊亂或出現誤釋的情況。然而,熒光蛋白技術仍然是觀察活細胞的首選方法。

    免疫熒光法利用了抗體可以和相應抗原特異性結合的這個特性,對此它還有兩種不同的表現形式。最簡單的方式是使用可與目的蛋白相結合的熒光標記抗體。這種方法被稱為“直接免疫熒光法”。

    在很多情況下,我們可以利用兩種不同特性的抗體。第一種抗體可以結合目的蛋白,但其本身并未進行熒光標記(一抗)。第二種抗體本身就攜帶熒光染料(二抗),并且可以特異性結合一抗。這種方法被稱為“間接免疫熒光法”。這種方法存在諸多優勢。一方面,它會產生放大效應,因為不只一個二抗可以與一抗相結合。另一方面,沒有必要始終用熒光染料標記目的蛋白的每個抗體,但可以使用市售熒光標記的二抗。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料包括 FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor?染料,下文均有提及。

FITC 和 TRITC

    異硫氰酸熒光素(FITC) 是一種有機熒光染料,目前,這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細胞術中。在 495/517 nm 處,該染料會產生激發/發射峰值,并可借助異硫氰酸鹽反應基團與不同抗體結合,該基團可以和蛋白質上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團相結合。而它的基本成分—— 熒光素,其摩爾質量為 332 g/mol,常被用作熒光示蹤劑。FITC(389 g/mol) 是用于熒光顯微鏡技術的首批染料,且其被當成 Alexa Fluor?488 等后續熒光染料的發端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統,而該系統受藍色光譜中的光所激發。

    經常與 FITC 同時使用的另一種染料是與其相似的TRITC [四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與 FITC 相反,TRITC 并非熒光素,而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明也具有一個大的共軛芳香電子系統,正是該系統引發了它們的熒光行為。還有一點與FITC 相反,TRITC (479 g/mol) 由最大波長為 550nm的綠色光譜中的光所激發,它的最大發射波長為 573 nm。與蛋白質(例如,抗體)結合也基于異硫氰酸鹽反應基團。

    雖然 FITC 和 TRITC 仍在使用,但由于它們屬于發光相對較弱的熒光染料且它們的優勢僅僅是經濟實惠,因此,在最新的顯微鏡技術中并不推薦。

青色素

    這類熒光染料相對較少,從青色素衍生而來,也是其名稱的由來:Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通過其反應基團與核酸或蛋白相連。例如,采用了蛋白標記的馬來酰亞胺基團。有趣的是,對于熒光,Cy5 對其周邊電子環境非常敏感,該特征可用于酶測定。附著蛋白質的構象改變會導致熒光發射產生陽性或陰性變化。此外,Cy3 和 Cy5 還可用于 FRET 試驗。青色素染料是一種相對較老的熒光染料,但卻是其他熒光染料在亮度、耐光性、量子產率等方面得以改善的基礎。

Alexa Fluor?染料

    Alexa Fluor?染料是帶負電荷且親水的熒光染料系列,該系列染料囊括范圍較廣,且經常用于熒光顯微鏡技術之中。這些染料的名稱是由其發明者Richard Paul Haugland 以他兒子 Alex Haugland 的名字命名的。該產品標識是 Molecular Probes(美國生命科學技術公司 Life Technologies旗下子公司,注:2014年2月Life Technologies被Thermo Fisher收購)的商標。此外,這些產品標識中也涵蓋了相應的激光激發波長。例如,應用范圍很廣且最大激發波長為 493 nm的Alexa Fluor?488,可由標準的488 nm激光激發。Alexa Fluor?488的最大發射波長為 519 nm,正是因為具備上述特性,使得 Alexa Fluor?488與 FITC 的屬性相似。盡管 Alexa Fluor?488是一種熒光素衍生物,但與 FITC 相反,它擁有更佳的穩定性和熒光亮度,且 pH 敏感度也更低。所有 Alexa Fluor? 染料(比如,Alexa Fluor?546、Alexa Fluor?633)都是不同基礎熒光物質的磺化形式,例如,熒光素、香豆素、青色素或羅丹明,它們的摩爾質量在410 至 1400 g/mol 范圍之內。

DNA 染色

    在熒光顯微鏡技術中,不只研究蛋白結構,核酸同樣具有重要的研究意義。有時候,必須通過檢測細胞核來確定細胞的精確位置及其數量。最常用的一種DNA 染色劑當屬 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) ,其可與DNA 雙螺旋的 A-T 富集區域相結合。如果 DAPI 附著到 DNA 上,其熒光強度將比游離狀態要高。該染色劑受最大波長為358 nm的紫外光激發,其發射光譜非常寬,在461 nm 處達到峰值。此外,還可對弱熒光進行 RNA 結合檢測。在這種情況下,發射波長將轉移至 500 nm。有趣的是,DAPI 能夠穿透整個細胞膜。因此,它可以用于固定和活細胞之中。

    第二種被廣泛使用的DNA 染色劑就是 Hoechst 染料系列,這些染料原先都是由 Hoechst AG 這家化學公司生產的。Hoechst 33258、Hoechst 33342以及Hoechst 34580 均為雙苯酰亞胺,可嵌入 A-T 富集區域,因此,該系列染料很少用到。與 DAPI 相似,這三種染色劑都可受最大發射波長為455 nm的紫外光激發,而未被結合的染色劑,其最大發射波長在 510–540 nm 之間。Hoechst 染色劑還具有細胞滲透性,因此可用于活細胞或已固定的細胞中。該染色劑與DAPI 的不同之處在于,它們的毒性較低。

碘化丙啶(Propidium-Iodide,PI)是一種不能透過細胞膜的 DNA 染色劑。由于具備上述特性,該染色劑無法進入完整的細胞中,因此,該染色劑常用于區分細胞群中的活細胞和死細胞。此外,碘化丙啶還是一種嵌入劑,但對于不同的堿基并不存在結合的差異性。該染色劑與核酸結合后,最大激發波長為538 nm,最大發射波長為 617 nm。未結合 PI 的最大激發和發射波長和光強會更低一些。PI 還可結合 RNA,同時無需改變自身的熒光特性。有時候為了區分DNA 和 RNA,有必要使用適當的核酸酶。

    不需要前期處理,吖啶橙就可以鑒別DNA 與 RNA 。吖啶橙與 DNA 結合后,最大激發/發射波長為 502 nm/525 nm,而與 RNA 結合后,最大激發/發射波長為460 nm/650 nm。此外,它還能夠進入溶酶體等酸性區室。在這里,陽離子染料被質子化。在這種酸性環境下,吖啶橙由藍色光譜中的光激發,但發射波長在橙色區域達到最大。由于凋亡細胞具有大量被吞噬的酸性區室,因此,吖啶橙常用作此類細胞的標記物。

區室和細胞器特異性染料

    在熒光顯微鏡技術中,往往要對溶酶體、核內體等細胞區室以及線粒體等細胞器進行染色。為此,該部分介紹了一系列可供選擇使用的特異性染料。

    觀察線粒體最常用的方法就是利用 MitoTracker?,它是一種可透過細胞的染料,包含輕度巰基化的氯甲基活性部分。正因如此,它可與半胱氨酸殘基的游離硫醇基反應,從而與基質蛋白實現共價結合。MitoTracker? 有不同的顏色和修飾類型(參見表 1),此外,它還是 Molecular Probes 的商標。與羅丹明 123 (Rh123) 或 tetramethylrosamine等常規線粒體特異性染色劑不同,在用固定劑破壞膜電位后,MitoTracker?不會被洗掉。

    依據線粒體染色劑,還有些染料可以標記溶酶體等酸性區室,這類染料被稱為LysoTracker。它們由連接一個熒光基團的弱堿基團組成,具有膜穿透性。最有可能的情況是,這些堿基因質子化作用的影響而對酸性區室具有親和性。LysoTracker具有多種不同的顏色可供選擇(參見表 1)。

與溶酶體相似的區室是釀酒酵母等真菌中的液泡,這種膜密閉空間也是一種酸性環境。如果要在熒光顯微鏡下觀察上述區室,則要使用FM 4-64?或FM 5-95?等苯乙烯基染料。

    對于蛋白質分泌實驗,內質網 (ER) 具有重要的研究意義。對上述區室進行染色的一種典型染料為DiOC6(3)。該染料雖然偏好 ER,但仍會結合線粒體等其他細胞器膜。對ER 進行特異性染色的另一種方法是,使用 ER-Tracker Green 和 Red 等 ER-Tracker,而 ER-Tracker Green 和 Red 是基于 BODIPY 的兩種染料,其與格列本脲(一種磺酰基脲酶)連接,并可與僅存于內質網膜上的ATP敏感性鉀通道結合。BODIPY(硼-二吡咯亞甲基,boron-dipyrromethene)是一種幾乎不溶于水的、對pH 相對不敏感的染料基團,該染料對蛋白質標記沒太大用處,但卻是脂質和膜標記的良好工具。

    對于與ER相鄰的高爾基體,可以用 NBD C6-ceramide 和BODIPYFL C5-ceramide 等熒光神經酰胺類似物對其進行標記。 上述神經酰胺為鞘脂類,其在高爾基體中高度富集。

    借助基于脂質的染料,可以對脂筏等特異膜區域進行染色。使用 NBD-6Cholestrol或NBP-12 Cholesterol 可以觀察膽固醇富集區域(Avanti Polar Lipids)。

    除了使用特異性非蛋白熒光染料對細胞區室進行標記之外,還可以借助對細胞中不同位置有偏好的蛋白質對目標區域進行染色。這些蛋白質可以和熒光染料相連,并可通過熒光顯微鏡進行觀察。運用這種方法的一個實例是:麥胚凝集素(WGA) 可以與細胞質膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特異性結合,將WGA 與熒光染料偶聯,這樣我們就可以觀察到細胞質膜了。

離子成像

在有關神經元方面的研究中,觀察基因活性或細胞運動等對于了解細胞的離子濃度具有重要意義。鈉、鈣、氯或鎂離子對很多不同的細胞活動都具有較大影響。一般情況下,借助熒光標記的螯合劑可將離子困住,螯合劑在結合相應離子后會改變離子的光譜特性。例如,利用該原理的鈣指示劑fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和Calcium-Green 等。

對于鈉離子的檢測,通常使用 SBFI (sodium-bindingbenzofurzanisophthalate) 或Sodium Green。PBFI(potassium-binding benzofurzanisophthalate) 可以檢測鉀離子。

有趣的是,還存在以蛋白質為主的鈣指示劑,其中一種是基于水母化學發光蛋白—水母素。水母素、發光體腔腸素、分子氧和 Ca2+的相互作用會釋放藍光,這是在熒光蛋白質的發現過程中非常著名的機制。

熒光染料及其激發和發射波長峰值

    上文提到的所有染料在下表中均有統計。此外,還涵蓋了其他熒光染料及其激發和發射波長峰值。

熒光染料示例

激發光

Indo-1,  Ca saturated

331 nm

Indo-1  Ca2+

346 nm

Cascade  Blue BSA pH 7.0

401 nm

Cascade  Blue

398 nm

LysoTracker  Blue

373 nm

Alexa  405

401 nm

LysoSensor  Blue pH 5.0

374 nm

LysoSensor  Blue

374 nm

DyLight  405

399 nm

DyLight  350

332 nm

BFP  (Blue Fluorescent Protein)

380 nm

Alexa  350

343 nm

7-Amino-4-methylcoumarin  pH 7.0

346 nm

Amino  Coumarin

345 nm

AMCA  conjugate

347 nm

Coumarin

360 nm

7-Hydroxy-4-methylcoumarin

360 nm

7-Hydroxy-4-methylcoumarin  pH 9.0

361 nm

6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin  pH 9.0

358 nm

Hoechst  33342

352 nm

Pacific  Blue

404 nm

Hoechst  33258

352 nm

Hoechst  33258-DNA

352 nm

Pacific  Blue antibody conjugate pH 8.0

404 nm

PO-PRO-1

434 nm

PO-PRO-1-DNA

435 nm

POPO-1

433 nm

POPO-1-DNA

433 nm

DAPI-DNA

359 nm

DAPI

358 nm

Marina  Blue

362 nm

SYTOX  Blue-DNA

445 nm

CFP  (Cyan Fluorescent Protein)

434 nm

eCFP  (Enhanced Cyan Fluorescent Protein)

437 nm

1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic  acid (1,8-ANS)

375 nm

Indo-1,  Ca free

346 nm

1,8-ANS  (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid)

375 nm

BO-PRO-1-DNA

462 nm

BOPRO-1

462 nm

BOBO-1-DNA

461 nm

SYTO  45-DNA

451 nm

evoglow-Pp1

448 nm

evoglow-Bs1

448 nm

evoglow-Bs2

448 nm

Auramine  O

431 nm

DiO

487 nm

LysoSensor  Green pH 5.0

447 nm

Cy 2

489 nm

LysoSensor  Green

447 nm

Fura-2,  high Ca

336 nm

Fura-2  Ca2+sup>

336 nm

SYTO  13-DNA

488 nm

YO-PRO-1-DNA

491 nm

YOYO-1-DNA

491 nm

eGFP  (Enhanced Green Fluorescent Protein)

488 nm

LysoTracker  Green

503 nm

GFP  (S65T)

489 nm

BODIPY  FL, MeOH

502 nm

Sapphire

396 nm

BODIPY  FL conjugate

503 nm

MitoTracker  Green

490 nm

MitoTracker  Green FM, MeOH

490 nm

Fluorescein  0.1 M NaOH

493 nm

Calcein  pH 9.0

494 nm

Fluorescein  pH 9.0

490 nm

Calcein

493 nm

Fura-2,  no Ca

367 nm

Fluo-4

494 nm

FDA

495 nm

DTAF

495 nm

Fluorescein

495 nm

Fluorescein  antibody conjugate pH 8.0

493 nm

CFDA

495 nm

FITC

495 nm

Alexa  Fluor 488 hydrazide-water

493 nm

DyLight  488

493 nm

5-FAM  pH 9.0

492 nm

FITC  antibody conjugate pH 8.0

495 nm

Alexa  488

493 nm

Rhodamine  110

497 nm

Rhodamine  110 pH 7.0

497 nm

Acridine  Orange

431 nm

Alexa  Fluor 488 antibody conjugate pH 8.0

499 nm

BCECF  pH 5.5

485 nm

PicoGreendsDNA  quantitation reagent

502 nm

SYBR  Green I

498 nm

Rhodaminen  Green pH 7.0

497 nm

CyQUANT  GR-DNA

502 nm

NeuroTrace  500/525, green fluorescent Nissl stain-RNA

497 nm

DansylCadaverine

335 nm

Rhodol  Green antibody conjugate pH 8.0

499 nm

Fluoro-Emerald

495 nm

Nissl

497 nm

Fluorescein  dextran pH 8.0

501 nm

Rhodamine  Green

497 nm

5-(and-6)-Carboxy-2',  7'-dichlorofluorescein pH 9.0

504 nm

DansylCadaverine,  MeOH

335 nm

eYFP  (Enhanced Yellow Fluorescent Protein)

514 nm

Oregon  Green 488

498 nm

Oregon  Green 488 antibody conjugate pH 8.0

498 nm

Fluo-3

506 nm

BCECF  pH 9.0

501 nm

SBFI-Na+

336 nm

Fluo-3  Ca2+

506 nm

Rhodamine  123, MeOH

507 nm

FlAsH

509 nm

Calcium  Green-1 Ca2+

506 nm

Magnesium  Green

507 nm

DM-NERF  pH 4.0

493 nm

Calcium  Green

506 nm

Citrine

515 nm

LysoSensor  Yellow pH 9.0

335 nm

TO-PRO-1-DNA

515 nm

Magnesium  Green Mg2+

507 nm

Sodium  Green Na+

507 nm

TOTO-1-DNA

514 nm

Oregon  Green 514

512 nm

Oregon  Green 514 antibody conjugate pH 8.0

513 nm

NBD-X

466 nm

DM-NERF  pH 7.0

509 nm

NBD-X,  MeOH

467 nm

CI-NERF  pH 6.0

513 nm

Alexa  430

431 nm

Alexa  Fluor 430 antibody conjugate pH 7.2

431 nm

CI-NERF  pH 2.5

504 nm

Lucifer  Yellow, CH

428 nm

LysoSensor  Yellow pH 3.0

389 nm

6-TET,  SE pH 9.0

521 nm

Eosin  antibody conjugate pH 8.0

525 nm

Eosin

524 nm

6-Carboxyrhodamine  6G pH 7.0

526 nm

6-Carboxyrhodamine  6G, hydrochloride

525 nm

Bodipy  R6G SE

528 nm

BODIPY  R6G, MeOH

528 nm

6 JOE

520 nm

Cascade  Yellow antibody conjugate pH 8.0

399 nm

Cascade  Yellow

399 nm

mBanana

540 nm

Alexa  Fluor 532 antibody conjugate pH 7.2

528 nm

Alexa  532

528 nm

Erythrosin-5-isothiocyanate  pH 9.0

533 nm

6-HEX,  SE pH 9.0

534 nm

mOrange

548 nm

mHoneydew

478 nm

Cy 3

549 nm

Rhodamine  B

543 nm

DiI

551 nm

5-TAMRA-MeOH

543 nm

Alexa  555

553 nm

Alexa  Fluor 555 antibody conjugate pH 7.2

553 nm

DyLight  549

555 nm

BODIPY  TMR-X, SE

544 nm

BODIPY  TMR-X, MeOH

544 nm

PO-PRO-3-DNA

539 nm

PO-PRO-3

539 nm

Rhodamine

551 nm

Bodipy  TMR-X conjugate

544 nm

POPO-3

533 nm

Alexa  546

562 nm

BODIPY  TMR-X antibody conjugate pH 7.2

544 nm

Calcium  Orange Ca2+

549 nm

TRITC

550 nm

Calcium  Orange

549 nm

Rhodaminephalloidin  pH 7.0

558 nm

MitoTracker  Orange

551 nm

MitoTracker  Orange, MeOH

551 nm

Phycoerythrin

565 nm

Magnesium  Orange

550 nm

R-Phycoerythrin  pH 7.5

565 nm

5-TAMRA  pH 7.0

553 nm

5-TAMRA

549 nm

Rhod-2

552 nm

FM  1-43

472 nm

Rhod-2  Ca2+

553 nm

Tetramethylrhodamine  antibody conjugate pH 8.0

552 nm

FM  1-43 lipid

473 nm

LOLO-1-DNA

568 nm

dTomato

554 nm

DsRed

563 nm

Dapoxyl  (2-aminoethyl) sulfonamide

372 nm

Tetramethylrhodamine  dextran pH 7.0

555 nm

Fluor-Ruby

554 nm

Resorufin

571 nm

Resorufin  pH 9.0

571 nm

mTangerine

568 nm

LysoTracker  Red

578 nm

Lissaminerhodamine

572 nm

Cy 3.5

578 nm

Rhodamine  Red-X antibody conjugate pH 8.0

573 nm

Sulforhodamine  101, EtOH

578 nm

JC-1  pH 8.2

593 nm

JC-1

592 nm

mStrawberry

575 nm

MitoTracker  Red

578 nm

MitoTracker  Red, MeOH

578 nm

X-Rhod-1  Ca2+

580 nm

Alexa  Fluor 568 antibody conjugate pH 7.2

579 nm

Alexa  568

576 nm

5-ROX  pH 7.0

578 nm

5-ROX  (5-Carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt)

578 nm

BO-PRO-3-DNA

574 nm

BOPRO-3

574 nm

BOBO-3-DNA

570 nm

Ethidium  Bromide

524 nm

ReAsH

597 nm

Calcium  Crimson

589 nm

Calcium  Crimson Ca2+

590 nm

mRFP

585 nm

mCherry

587 nm

Texas  Red-X antibody conjugate pH 7.2

596 nm

HcRed

590 nm

DyLight  594

592 nm

Ethidium  homodimer-1-DNA

528 nm

Ethidiumhomodimer

528 nm

Propidium  Iodide

538 nm

SYPRO  Ruby

467 nm

Propidium  Iodide-DNA

538 nm

Alexa  594

590 nm

BODIPY  TR-X, SE

588 nm

BODIPY  TR-X, MeOH

588 nm

BODIPY  TR-X phallacidin pH 7.0

590 nm

Alexa  Fluor 610 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2

567 nm

YO-PRO-3-DNA

613 nm

Di-8  ANEPPS

469 nm

Di-8-ANEPPS-lipid

469 nm

YOYO-3-DNA

612 nm

Nile  Red-lipid

553 nm

Nile  Red

559 nm

DyLight  633

624 nm

mPlum

587 nm

TO-PRO-3-DNA

642 nm

DDAO  pH 9.0

648 nm

Fura  Red, high Ca

434 nm

Allophycocyanin  pH 7.5

651 nm

APC  (allophycocyanin)

650 nm

Nile  Blue, EtOH

631 nm

TOTO-3-DNA

642 nm

Cy 5

646 nm

BODIPY  650/665-X, MeOH

646 nm

Alexa  Fluor 647 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2

569 nm

DyLight  649

652 nm

Alexa  Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2

653 nm

Alexa  647

653 nm

Fura  Red Ca2+

435 nm

Atto  647

644 nm

Fura  Red, low Ca

472 nm

Carboxynaphthofluorescein  pH 10.0

600 nm

Alexa  660

664 nm

Alexa  Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2

663 nm

Cy 5.5

673 nm

Alexa  Fluor 680 antibody conjugate pH 7.2

679 nm

Alexa  680

679 nm

DyLight  680

678 nm

Alexa  Fluor 700 antibody conjugate pH 7.2

696 nm

Alexa  700

696 nm

FM  4-64, 2% CHAPS

506 nm

FM  4-64

508 nm


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